TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA

QUÉ ES LA INGENIERÍA GENÉTICA

La ingeniería genética es el conjunto de técnicas que permiten recodificar el ADN de un organismo con el fin de cambiar la información que contiene. Como consecuencia, la ingeniería genética sirve para clonar fragmentos de ADN y para expresar genes (producir las proteínas para las cuales estos genes codifican) en organismos diferentes al de origen. La manipulación de la secuencia genética ha supuesto una revolución espectacular en el progreso científico y técnico.

TÉCNICAS DE INGENIERIA GENÉTICA

La técnica más empleada es la técnica del ADN recombinante. Esta técnica consiste en aislar un gen de un organismo y ponerlo en otro diferente. La finalidad de esta tecnología es aportar a un organismo nuevas características como por ejemplo, la de producir una proteína que antes no se podía hacer, o eliminar un compuesto toxico que antes de la manipulación resultaba mortal.

Otras técnicas podrían ser la amplificación del ADN por clonación bacteriana o por PCR, la secuenciación del ADN genómico y la transferencia nuclear (clonación).

Generación de ADN recombinante para expresar proteínas. El primer paso es la identificación de una secuencia de ADN de un organismo que resulta de interés, y cortarla mediante enzimas de restricción.
Procediendo de una manera similar, se corta el trozo de ADN de la bacteria receptora. Los extremos generados, complementarios tenderán a unirse por lo que se les llama cohesivos. Las ADN ligasas unen el fragmento de ADN deseado al ADN receptor y se forma así el ADN recombinante. Mediante técnicas diversas como el aumento de temperatura o añadiendo calcio, se introduce el plásmido con la secuencia extraña incorporada a una bacteria receptora o a otro organismo. Luego la bacteria se podrá encargar en su caso de producir la proteína codificada por el gen recombinante construido.

Figura 1. Formación del plásmido e introducción en bacterias (izda) y actuación de un enzima de restricción.

Amplificación de la cantidad de ADN. Para muchos experimentos de ingeniería genética necesitamos disponer de cantidades considerables de ADN. Para ellos se pueden usar bacterias que han sido trasnfectadas con plasmidos que contienen el ADN de interés. Las bacterias empezarás a reproducirse hasta formar miles de clones con el mismo plásmido.

Otra manera de amplificar el ADN construido consiste en utilizar la reacción en cadena de la polimerasa. Esta técnica, que se llama PCR, se basa en utilizar la enzima que interviene en la replicación del ADN, que se llama ADN polimerasa, para extender primeros (cebadores) usando como molde las cadenas de ADN complementarias. Mediante muchos ciclos de cambios de temperatura que permiten unir y desunir las cadenas, se obtiene en poco tiempo una enorme cantidad del ADN inicial a partir de una pequeña muestra; esta técnica se usa mucho en medicina forense, al ser muy rápida y requerir cantidades muy pequeñas.

bio 3 borrar

Figura 2. Esquema de la PCR

Aislamiento del ADN

Una vez obtenidos los fragmentos de ADN deseados y en cantidad, debemos pasarlos por un filtro con técnicas como la cromatografía y la electroforesis. Hay que encontrar el fragmento que deseamos mediante técnicas de hibridación.
Hoy en día todo está muy automatizado y se utilizan unos aparatos llamados secuenciadores que permiten detectar fácilmente el ADN buscado. Gracias a estos se consiguieron reconstruir genomas de diferentes organismos.

Técnicas de clonación y de terapia génica

Disponiendo de los ADNs de interés se pueden introducir en células receptoras, que a partir de ahora serán células transgénicas, ya que su núcleo contendrá su propio ADN y un pedazo extraño.

  • La clonación es una técnica de transferencia nuclear que puede ser considerado una forma especial de la transgénesis en el que transfiere un genoma completo que produce organismos genéticamente idénticos entre sí. Se distinguen 2 tipos de clonación: la no reproductiva o terapéutica (que crea embriones o cultivos celulares por clonación para producir tejidos o órganos con los que reparar otros equivalentes) y la clonación reproductiva (prohibida), a partir de una célula adulta.

bio 4 borrar

Figura 3. Clonación de una oveja

  • La terapia génica es un tratamiento médico que consiste en manipular la información genética de células enfermas para corregir un defecto genético o para dotar a las células una nueva función que les permita superar una alteración. Se utilizan estrategias ex vivo, in vivo y in situ (introduciendo los genes directamente en los tejidos)

bio 5 borrar

Figura 4. Terapia génica

Este tipo de terapias son muy difíciles de llevar a cabo, debido entre otras cosas a la falta de selectividad de secuencia. Además en las técnicas in situ y ex vivo, los genes implantados no producen suficiente cantidad de proteína.

APLICACIÓN DE LA INGENIERÍA GENETICA EN LA PRODUCCIÓN DE INSULINA

La insulina es una hormona que se produce en las células beta del páncreas de forma natural, y se libera en mayor cantidad cada vez que se produce un aumento en los niveles de azúcar en sangre, lo que ocurre fundamentalmente después de comer. Eso pasa cuando el cuerpo toma los alimentos ingeridos y los convierte en azúcar (glucosa).

La insulina se puede liberar de dos formas, la primera es más rápida, y se da cuando los niveles de azúcar suben; la segunda produce una liberación sostenida y lenta de vesículas que se activan independientemente de la cantidad de azúcar en la sangre.

La insulina actúa como una llave que facilita la entrada de azúcar desde la sangre a la célula, y con ello su catabolismo.

La segregación de insulina se lleva a cabo mediante un proceso complejo generado en diversas partes del cuerpo.

Cuando, por algún motivo la insulina no se segrega o no funciona de forma correcta, el azúcar no puede entrar en la célula, y permanece en el torrente sanguíneo. Esto causa niveles de azúcar demasiado alto en la sangre (hiperglucemia), más conocido como diabetes.

Al principio, cuando alguien padecía diabetes, se le trataba con insulina porcina, ya que era casi igual que la humana, pero a la larga, los pacientes acababan rechazándola, por eso se comenzó a utilizar la sintética.

La insulinoterapia es el tratamiento al que se someten los pacientes de diabetes por la administración de insulina exógena, la cual se adquiere por medio de ingeniería genética. Suele haber varios tipos, con respecto al tipo de diabetes que tenga la persona (tipo1, tipo 2…)

La insulina es el primer caso de proteína producida por ingeniería genética  aprobada para uso en humanos desde 1982. En la actualidad, varios laboratorios farmacéuticos producen insulina humana, tanto a partir de bacterias como de levaduras, y sin ningún riesgo para la salud. En la siguiente figura, se muestra un esquema general de la obtención de insulina a partir de páncreas de vacas o cerdos, y mediante ingeniería genética.

bio 6 borrar

Figura 5. Producción de insulina por ingeniería genética (dcha)

Si bien estos son los pasos a seguir para la obtención de insulina recombinante, si se inserta en el plásmido bacteriano el gen entero de la insulina, se obtendría como resultado la preproinsulina.  Para evitar estas dificultades se sintetizan químicamente las secuencia de ADN correspondiente a las cadenas polipeptídicas A y B que se insertan separadamente en un gen bacteriano. Los plásmidos recombinantes se introducen en bacterias E. coli, donde se multiplican. Una vez purificadas las dos cadenas, se unen mediante una reacción que forma puentes disulfuro (de azufre) y se obtiene insulina humana pura. El producto final, la insulina humana biosintética, es idéntica en todos los aspectos a la insulina purificada del páncreas humano.

CRISPR-Cas9: El bisturí genético

 

Cada célula de nuestro cuerpo contiene una copia de nuestro genoma, sobre 20.000 genes y 3 billones de letras de ADN. El ADN consiste en dos hebras en forma de doble hélice y unidas por una simple regla de emparejamiento, en la que la A (adenina) se enlaza con la T (timina), y la G (guanina) con C (citosina). Mediante los procesos de expresión genética los genes dan lugar a ARNs mensajeros, y estos a proteínas, de tal forma que cada proteína está codificada por la secuencia de letras de los genes.

Podemos pues decir que cada genoma es como un libro en el que están escritas las palabras y textos que regulan nuestra vida. De hecho los genes determinan como somos como individuos y afectan directamente a nuestra salud, pues cuando se producen errores o mutaciones, pueden generarse enfermedades como el cáncer. Las investigaciones de secuenciación de ADN que se han llevado a cabo en los últimos años han permitido detectar miles de genes que que presentan mutaciones y que pueden por lo tanto determinar el origen de muchas enfermedades. La mejor solución para poder abordar las enfermedades causadas por estas alteraciones genéticas consistiría en sustituir la secuencia errónea del genoma por la correcta, lo que se ha venido a llamar terapia génica.

Este tipo de edición genética ha estado fuera del alcance de los científicos por mucho tiempo, pero recientemente se ha descubierto una tecnología, denominada CRISPR-Cas9, que ha abierto un innumerable número de posibilidades para poder realizar procesos de edición genética.

Esta tecnología consiste en una especie de bisturí molecular que permite cortar cualquier molécula de ADN en un lugar determinado de su secuencia, y así eliminar la secuencia errónea e incluso sustituirla por la nueva. Es como si pudiéramos editar un libro en documento Word y así poder borrar o cambiar las palabras o textos que queramos, simplemente poniendo el cursor en el lugar adecuado.

El desarrollo de esta técnica se ha inspirado en el sistema inmunogénico que usan las bacterias para protegerse de las infecciones víricas, y que fue en parte descubierto por el microbiólogo español Francis Mójica de la Universidad de Alicante.

Cuando un virus entra dentro de la bacteria toma el control de la maquinaria celular y para ello interacciona con distintos componentes celulares. Algunas bacterias han desarrollado un sistema de defensa consistente en una secuencia genética que por una parte codifica una nucleasa (CAS9), y por otra tiene unas secuencias repetidas llamadas CRISPR entre las que se aloja un trozo de ADN del virus (en los espaciadores).

bio 7 borrar

Figura 6. Secuencias de CaS y CRISPR

Cada vez que el virus invade la bacteria con su ADN, la bacteria genera dos secuencias cortas de ARN mensajero a partir de la secuencia del virus que tiene en las CRISPR, para que se una al ADN del invasor (pues es complementario), y activa la nucleasa para que lo rompa y sea posteriormente degradado. Es, por lo tanto, un verdadero sistema inmune de bacterias.

En base a este sistema bacteriano que permite identificar secuencia concretas y romperlas, las investigadoras J. Doudna y E. Charpentier, que el año pasado ganaron el premio Princesa de Asturias, demostraron que era posible fragmentar cualquier secuencia genética de forma determinada, simplemente diseñando correctamente un ARN complementario que sirve de guía. Esto se ha hecho in vitro, pero también se ha demostrado que se puede hacer en el núcleo de una célula viva. Solo hay que diseñar el ARN guía e insertarlo en la célula, donde debe asociarse con la enzima Cas9.

bio 8 borrar

Figura 7. Esquema de la técnica CRISPR-Cas9

El ARN guía es especifico de una secuencia concreta de ADN, por lo que por las reglas de complementariedad de nucleótidos se unirá a la secuencia de ADN que interesa cortar o modificar. Entonces el Cas9, que es una enzima endonucleasa (una proteína capaz de romper un enlace de un polinucleótido), cortará la secuencia de ADN de interés. Es posible no solo cortar, sino también insertar un ADN nuevo, con lo que se abren unas vías impresionantes para hacer terapia génica.

 

ALICIA MASCAREÑAS PAZOS

SARA PRIETO SEÑARIS

CANDELA ABELENDA VÁZQUEZ